Laboratoorsete tööde juhend
Laboratoorne töö: Termofiilsete kampülobakterite tuvastamine ja loendamine toorest linnulihast
Kasutatavd meetodid:
EVS-EN ISO 10272-1:2006 - Toiduainete ja loomasööda mikrobioloogia. Horisontaalmeetod Campylobacter spp. tuvastamiseks ja loendamiseks. Osa 1: tuvastamise meetod.
ISO/TS 10272-2:2006(E) – Toiduainete ja loomasööda mikrobioloogia. Horisontaalmeetod Campylobacter spp. tuvastamiseks ja loendamiseks. Osa 2: kolooniate loendamise tehnika
Sissejuhatus:
Kampülobakterid on kõverdunud, S-kujulised või spiraalsed kepid, vanemates kultuurides võivad kampülobakterid esineda kerakujuliste bakteritena. Nad on gram-negatiivsed, polümorfsed, mikroaerofiilsed kuni anaeroobsed (3–5% O2) ja oksüdaas-positiivsed mikroorganismid. Nad ei moodusta spoore, ei fermenteeri ega oksüdeeri süsivesikuid. Kampülobakteritele on iseloomulik kiire ringliikumine tänu üksikule polaarsele viburile. Kampülobakterid on väikesed, nende pikkus on 0,5–5,0 μm ning läbimõõt 0,2–0,9 μm. Kampülobakteritest tingitud infektsioonid esinevad peamiselt sporaadiliselt ning enamasti suvel ja on põhjustatud eeskätt toiduainete ebapiisavast kuumtöötlemisest. Enamasti on inimeste haigestumine kampülobakterioosi tingitud alaküpsetatud kanaliha ja teiste liharoogade tarbimisest, toorpiima ja töötlemata vee joomisest ning lemmikloomadega (kassid, koerad) kokkupuutest, kes on sageli eelpool mainitud bakterite kandjateks. Kampülobakteritest põhjustatud enteriiti esineb kõikidesse vanusegruppi kuuluvatel inimestel, kuid kõige rohkem esineb haigestumisi väikelaste ning 20 kuni 40 aastaste täiskasvanute hulgas. Enam esineb haiguspuhanguid kevadel ja suvel olles põhiliselt tingitud kontamineeritud piima ja joogivee tarbimisest. Patsiendid, kes on tabandunud C. jejuni või C. coli infektsioonist, võivad haigestuda sümptomaatiliselt või nakatuda asümptomaatiliselt. Sümptomitest prevaleerivad palavik, kõhuvalu ja kõhulahtisus (sageli verine). Haigusele iseloomulikke sümptomeid võib täheldada mitme päeva kuni mitme nädala jooksul. Paranemine toimub tavaliselt ilma ravita, kuid püsib suur tõenäosus reinfektsiooniks. Kampülobakteritest tingitud infektsioonide sümptomid võivad sarnaneda ägeda apenditsiidi sümptomitega, mis võib lõppeda mittevajaliku kirurgilise operatsiooniga. Ekstraintestinaalse infektsioonina või kroonilise järelhaigusena esinevad bakterieemiad, artriidid, bursiidid, meningiidid, endokardiidid, peritoniidid, pankreatiidid, kuseteede infektsioonid, abordid, neonataalsed sepsised.
Ettevaatusabinõud praktikumis:
1. Alates teisest praktikumist tööta üksnes kinnastatud kätega ning PEA MEELES, ET TÖÖTAD PATOGEENIDEGA.
2. Töö sooritamine eeldab hoolikat aseptilist tehnikat.
3. Tööpindade saastumisel desinfitseeri kohe saastunud kohad etanooli või mõne teise desinfektandiga.
4. Töövahendite paigutamisel järgi juhendajate juhiseid ning häid laboratooriumi tavasid.
Kõikide külvide sooritamise juures on vaja markeerida tassid ja katseklaasid enne külvama asumist. Reeglina kirjutatakse tassi kaanele enda nimi, rühm ja kuupäev ning põhjale andmed külvatavate mikroobide kohta. Tassid külvidega pannakse kindlasti kasvama põhi ülespoole.
TÖÖDE JÄRJESTUS
Esimene labor:
1. Esimese lahjenduse (10-1) saamiseks võta steriilne Stomacher kilekott ja kasutades steriilseid pintsette ja kääre kaalu 10 grammi linnulihaproovi (soovitavalt nahka) Stomacheri kilekotti ja lisa 90 ml steriilset puhverdatud peptoon-vett (lahjend e. lahjendusvedelik). Sega proov ühtlaselt kasutades Stomacher-tüüpi homogenisaatorit ja loksuta selles proovi 30 – 60 sekundit.
2. Samast lihaproovist kanna 10 grammi proovimaterjali (soovitavalt nahka) steriilsesse Shotti söötmepudelisse ning seejärel lisa 90 ml steriilset Bolton rikastuspuljongit. Keera kork pudelile peale, sega proovimaterjali hoolikalt ning inkubeeri 41,5 ºC juures 40 kuni 48 tundi ehk kaks ööpäeva.
3. Võta kaks valmis m-CCD-agariga Petri tassi ühe proovi kohta ning markeeri tassid.
4. Kanna 0,1 ml 10-1 lahjendust e. algsuspensiooni kahele Petri tassile e. mõlemale mCCD-agar tassile 0,1 ml alglahjendust.
5. Aseta külvatud Petri tassid anaerostaati ning jälgi, et koos kursusekaaslaste Petri tassidega oleks anaerostaadi täitumine optimaalne.
6. Mikroaeroobse keskkonna tekitamiseks lisa anaerostaati 1 suur reagentide kotike (Campy-GenTM, Oxoid) ning sulge seejärel anaerostaat õhukindlalt.
7. Inkubeeri plaate mikroaeroobsetes tingimustes (anerostaat + Campy-GenTM) temperatuuril 41,5 ºC juures 40 kuni 48 tundi.
Kasutatavd meetodid:
EVS-EN ISO 10272-1:2006 - Toiduainete ja loomasööda mikrobioloogia. Horisontaalmeetod Campylobacter spp. tuvastamiseks ja loendamiseks. Osa 1: tuvastamise meetod.
ISO/TS 10272-2:2006(E) – Toiduainete ja loomasööda mikrobioloogia. Horisontaalmeetod Campylobacter spp. tuvastamiseks ja loendamiseks. Osa 2: kolooniate loendamise tehnika
Sissejuhatus:
Kampülobakterid on kõverdunud, S-kujulised või spiraalsed kepid, vanemates kultuurides võivad kampülobakterid esineda kerakujuliste bakteritena. Nad on gram-negatiivsed, polümorfsed, mikroaerofiilsed kuni anaeroobsed (3–5% O2) ja oksüdaas-positiivsed mikroorganismid. Nad ei moodusta spoore, ei fermenteeri ega oksüdeeri süsivesikuid. Kampülobakteritele on iseloomulik kiire ringliikumine tänu üksikule polaarsele viburile. Kampülobakterid on väikesed, nende pikkus on 0,5–5,0 μm ning läbimõõt 0,2–0,9 μm. Kampülobakteritest tingitud infektsioonid esinevad peamiselt sporaadiliselt ning enamasti suvel ja on põhjustatud eeskätt toiduainete ebapiisavast kuumtöötlemisest. Enamasti on inimeste haigestumine kampülobakterioosi tingitud alaküpsetatud kanaliha ja teiste liharoogade tarbimisest, toorpiima ja töötlemata vee joomisest ning lemmikloomadega (kassid, koerad) kokkupuutest, kes on sageli eelpool mainitud bakterite kandjateks. Kampülobakteritest põhjustatud enteriiti esineb kõikidesse vanusegruppi kuuluvatel inimestel, kuid kõige rohkem esineb haigestumisi väikelaste ning 20 kuni 40 aastaste täiskasvanute hulgas. Enam esineb haiguspuhanguid kevadel ja suvel olles põhiliselt tingitud kontamineeritud piima ja joogivee tarbimisest. Patsiendid, kes on tabandunud C. jejuni või C. coli infektsioonist, võivad haigestuda sümptomaatiliselt või nakatuda asümptomaatiliselt. Sümptomitest prevaleerivad palavik, kõhuvalu ja kõhulahtisus (sageli verine). Haigusele iseloomulikke sümptomeid võib täheldada mitme päeva kuni mitme nädala jooksul. Paranemine toimub tavaliselt ilma ravita, kuid püsib suur tõenäosus reinfektsiooniks. Kampülobakteritest tingitud infektsioonide sümptomid võivad sarnaneda ägeda apenditsiidi sümptomitega, mis võib lõppeda mittevajaliku kirurgilise operatsiooniga. Ekstraintestinaalse infektsioonina või kroonilise järelhaigusena esinevad bakterieemiad, artriidid, bursiidid, meningiidid, endokardiidid, peritoniidid, pankreatiidid, kuseteede infektsioonid, abordid, neonataalsed sepsised.
Ettevaatusabinõud praktikumis:
1. Alates teisest praktikumist tööta üksnes kinnastatud kätega ning PEA MEELES, ET TÖÖTAD PATOGEENIDEGA.
2. Töö sooritamine eeldab hoolikat aseptilist tehnikat.
3. Tööpindade saastumisel desinfitseeri kohe saastunud kohad etanooli või mõne teise desinfektandiga.
4. Töövahendite paigutamisel järgi juhendajate juhiseid ning häid laboratooriumi tavasid.
Kõikide külvide sooritamise juures on vaja markeerida tassid ja katseklaasid enne külvama asumist. Reeglina kirjutatakse tassi kaanele enda nimi, rühm ja kuupäev ning põhjale andmed külvatavate mikroobide kohta. Tassid külvidega pannakse kindlasti kasvama põhi ülespoole.
TÖÖDE JÄRJESTUS
Esimene labor:
1. Esimese lahjenduse (10-1) saamiseks võta steriilne Stomacher kilekott ja kasutades steriilseid pintsette ja kääre kaalu 10 grammi linnulihaproovi (soovitavalt nahka) Stomacheri kilekotti ja lisa 90 ml steriilset puhverdatud peptoon-vett (lahjend e. lahjendusvedelik). Sega proov ühtlaselt kasutades Stomacher-tüüpi homogenisaatorit ja loksuta selles proovi 30 – 60 sekundit.
2. Samast lihaproovist kanna 10 grammi proovimaterjali (soovitavalt nahka) steriilsesse Shotti söötmepudelisse ning seejärel lisa 90 ml steriilset Bolton rikastuspuljongit. Keera kork pudelile peale, sega proovimaterjali hoolikalt ning inkubeeri 41,5 ºC juures 40 kuni 48 tundi ehk kaks ööpäeva.
3. Võta kaks valmis m-CCD-agariga Petri tassi ühe proovi kohta ning markeeri tassid.
4. Kanna 0,1 ml 10-1 lahjendust e. algsuspensiooni kahele Petri tassile e. mõlemale mCCD-agar tassile 0,1 ml alglahjendust.
5. Aseta külvatud Petri tassid anaerostaati ning jälgi, et koos kursusekaaslaste Petri tassidega oleks anaerostaadi täitumine optimaalne.
6. Mikroaeroobse keskkonna tekitamiseks lisa anaerostaati 1 suur reagentide kotike (Campy-GenTM, Oxoid) ning sulge seejärel anaerostaat õhukindlalt.
7. Inkubeeri plaate mikroaeroobsetes tingimustes (anerostaat + Campy-GenTM) temperatuuril 41,5 ºC juures 40 kuni 48 tundi.
Foto: Mati Roasto, 2012
Foto selgitus: proovimaterjali ettevalmistamine ning alglahjenduste tegemine välisüliõpilaste poolt
Teine ja kolmas labor e. tõestustestide teostamine ettekasvatatud Campylobacter kolooniatest ja arvukuse määramine (võimalik alles pärast 40 tunnist inkubeerimist)
Tõestustestide tegemine:
Katalaastesti teostamiseks vali makromorfoloogiliste tunnuste alusel välja tüüpiline kampülobakteri koloonia ning kasutades steriilset külviaasa kanna materjal alusklaasile.
Sama külviaasa kasutades hajuta koloonia alusklaasi keskpinnale ning seejärel tilguta 1 tilk 3 % vesinikperoksiidi (H2O2) uuritava bakterimassi pinnale. Positiivsest reaktsioonist annab märku kiire hapnikumullikeste eraldumine.
Termofiilsed kampülobakterid on katalaas-positiivsed.
Oksüdaastesti teostamiseks kasuta kommertsiaalseid oksüdaastikke (Oxoid).
Võta oksüdaastikkude purgist välja 1 oksüdaastikk ning vii selle reagendiga immutatud ots kokkupuutesse plaadil kasvava tüüpilise kampülobakteri kolooniaga.
Eemalda oksüdaastikk kolooniast ning jälgi positiivse reaktsiooni teket 40 sekundi jooksul.
Positiivse reaktsiooni korral värvub tiku reagentidega ots värvus tume lillaks või siniseks.
Termofiilsed kampülobakterid on oksüdaas-positiivsed.
Liikuvustesti teostamiseks tilguta alusklaasile 1 tilk peptoonlahust (kampülobakterid kaotavad vees kiiresti liikumisvõime) ning suspendeeri sellesse tüüpiline kampülobakteri koloonia.
Aseta materjalile katteklaas.
Katteklaasi keskele tilguta 1 tilk immersioonõli ning teosta mikroskopeerimine kasutades 100 kordset suurendust ning õliimmersiooni.
Tee kindlaks liikuvuse esinemine.
Kampülobakterid liiguvad kiirete pöörlevate liigutustega – sageli meenutavad kajakaid.
Teosta gram-värvimine, selleks valmista märgpreparaat, lase sellel õhu käes kuivada ning fikseeri termiliselt.
Fikseeritud preparaati värvi 1 minuti jooksul kristallvioletiga.
Pese preparaati ettevaatlikult mõne sekundi jooksul destilleeritud veega.
Aseta preparaadile 1 minutiks 1 tilk värsket Lugoli (joodi) lahust.
Pese preparaati destilleeritud veega.
Dekoloreeri preparaati 30 sekundi jooksul dekoleraatoriga või 96 %-lise etanooliga.
Pese preparaati 5 sekundi jooksul destilleeritud veega ja kuivata ettevaatlikult filterpaberi ribaga.
Värvi preparaati 20-30 sekundi jooksul 0,25 %-lise safraniini lahusega.
Pese preparaat, kuivata preparaat ja mikroskopeeri õliimmersioonis.
Kampülobakterid värvustuvad gram-negatiivselt ehk roosakaspunaselt.
Kampülobakterite loendamine:
Vaatle Petri tassil väljakasvanud kolooniaid. Tüüpilised kampülobakterite kolooniad on väikesed, hallikasvalged ja veidi metalse läikega. Tingituna faktist, et kampülobakterid on liikuvad võib söötme pinnal mõnikord täheldada ka hajuskasvu. Oluline on, et ka nööpnõelapea suurused kolooniad saaks loendatud. Vigade vältimiseks on oluline eraldada lahustamata toote osakesed kolooniatest. Laialivalgunud kolooniad loenda kui üksikkolooniad. Kui vähem kui veerand tassi on kaetud laialivalgunud kolooniatega, loenda kolooniad ülejäänud tassi osal ja selle põhjal arvuta kolooniate arv tassil. Kui üle veerandi tassist on kaetud laialivalgunud kolooniatega eemaldatakse tass loendamisest.
Üldiselt tuleks loendada plaadid, mis sisaldavad 15 kuni 150 kolooniat ja see eeldab kahe järjestikuse lahjenduse kasutamist loendamisel. Meie katses on tegemist ainult 10-ne kordsete lahjendusega ja eeldame, et kolooniate arv plaadil on väike. Seega kasutame loendamise meetodit, kus mõlemad plaadid sisaldavad vähem kui 15 kolooniat:
N = Σa
V x n x d
kus:
N – mikroobide arv milliliitris või grammis
Σa on kahel plaadil loetletud tüüpiliste kolooniate summa;
V plaadile külvatud lahjendusvedeliku kogus milliliitrites;
n plaatide arv (meie katses 2);
d lahjendusfaktor (meie katses 10)
Väljenda tulemused järgnevalt:
arvatav kampülobakterite arvukus N Campylobacter per gramm toodet
NÄIDE
loetlemine andis järgnevad tulemused:
esimesest 10-kordsest lahjendusest saadi, 12 ja 13 kolooniat:
N = 12 + 13 = 25 = 1250
0,1 x 2 x 10-1 0,02
Saadud tulemus ümarda kahe esimese arvuni. Kui ümardatavaks numbriks on 5 ja sellele ei järgne teisi arve, siis ümarda järgnevalt: 11500 ümarda 12000 ja 28500 ümarda 28000. Kui 5‑le eelnenud arv on paaritu arv, siis lisandub sellele üks, kui 5-le eelnenud number on paarisarv, siis jääb see muutmatuks.
Ümardades tulemused meie näite puhul (1250) on kampülobakterite arvatav/hinnatav arvukus N 1200 ehk 1,2 x 103 mikroorganismi (Campylobacter) grammis või milliliitris tootes.
Foto: Mati Roasto, 2012
Jäta meelde:
Tsütokroom c test ehk oksüdaastest seisneb selles, et tsütokroom c (cyt c) on heemisisaldav ensüüm, mis katalüüsib elektronide ülekannet hapnikule, mille tagajärjel tekib vesi ja oksüdeeritud cyt c. Oksüdaastest põhineb p-fenüleendiamiini kasutamisel. Tsütokroom c oksüdeerib värvitu dimetüül-p-fenüleendiamiini violetseks indofenoolsiniseks.
Katalaas lagundab vesinikperoksiidi veeks ja hapnikuks. Bakterid, kes ei ole võimelised kasutama hapnikku, ei produtseeri katalaasi ning katalaastest osutub negatiivseks.
Gram-reaktiivsuse võti peitub gram-positiivsete ja gram-negatiivsete bakterite rakukesta erisuguses ehituses. Gram-positiivsete bakterite paks peptidoglükaankiht ei lase moodustunud kristallviolett-joodi värvikompleksi etanooliga välja pesta, sest see on suurem kui rakku sisenenud kristallvioleti molekul. Gram-negatiivsetest bakteritest pestakse kristallviolett-joodi kompleks alkoholiga välja, sest gram-negatiivsete bakterite rakukesta lipopolüsahhariidne välismembraan on alkoholi mõjul muutunud läbilaskvaks ja peptidoklükaankiht on õhuke.
Kampülobakterid on väikesed S- või V‑kujuliselt kõverdunud kepid (sageli meenutavad kajakaid).
Kontrollida võib ka kasvu esinemist aeroobsetes tingimustes: veriagarile (Oxoid) kanda CCDA agarilt tüüpilised pesad ning inkubeerida temperatuuril 37 °C 24 tundi. Termofiilsete kampülobakterite puhul kasv aeroobsetes tingimustes puudub.